2019. március: jegyzet, ökológia, portré, anyagtudomány, mikroszkópia, egyetem, nanotechnológia, kémia, biokémia, tudomány, neutronkutatás, biotechnológia, genomika, orvostudomány, közlekedés, energiagazdálkodás, elektronika, gépipar, okostechnológia, fenntarthatóság, innováció, egészségipar, élelmiszer, zöldkörnyezet, megújuló energia, atomenergia, ipar 4.0, ipari automatizálás, it

A fehérjekutatás és a gén­szabászat új eredményeiből

A korábbi sikeres találkozók folytatásaként biokémikusok és genetikusok negyedszer rendezik meg közös konferenciájukat március végén. Az egri eseményen a legújabb kutatási eredmények bemutatása mellett egy új szakosztály, a proteomikai megalakulását is bejelentik. E dinamikusan fejlődő tudományterület ismertetése mellett a géneditálás terén elért eredmények összefoglalását kértük szakértőktől.


A proteomika az élő szervezetben előforduló összes, szerkezetében akár a legkisebb mértékben eltérő fehérje megismerésével foglalkozó tudományterület, amely a genommal kapcsolatos kutatás mintájára, an­nak kiegészítőjeként jött létre, de ma már a genomikától független, önálló diszciplína. (A proteom fogalmat először az ausztrál Marc Wilkins használta 1994-ben.) A proteomika igen összetett molekuláris biológiai tudományág, mely nemcsak úgy tekinti a fehérjét, mint izolált molekulát, hanem figyelembe veszi a fehérje és környezete közötti kölcsönhatásokat is. Célja, hogy a kísérleti kezelések során azonosítsa az új, illetve nem várt változásokat a fehérjékben, meghatározza a kölcsönhatásokat és módosulásokat, valamint teljes képet mutasson a sejtben lejátszódó folya­matokról. Más módszerekkel ellentétben, melyek egy időben mindössze néhány fehérje meghatározását végzik, a proteomikai módszerekkel lehetőség nyílik egy vizsgálaton belül akár több ezer fehérje meghatározására, így nyomon követhető a változó környezetre adott dinamikus sejtválasz. A proteomika számos bonyolult módszert kombinál a fehérjék azonosítására és mennyiségi meghatározására. A gélalapú vizsgálatoknál például figyelembe kell venni a vizsgált fehérjék oldhatóságát, méretét, töltését, izoelektromos pontját. Mindig komoly problémát jelent a minták komplexitása, hiszen egy-egy szövettípus akár több ezer különböző fehérjét is tartalmazhat. Ezért okoz nehézséget, hogy megtalálják azokat a fehérjéket, melyek ténylegesen reagálnak az adott kezelésre.

A proteomika összetett molekuláris biológiai tudományág, mely figyelembe veszi a fehérje és környezete közötti kölcsönhatásokat is. Célja, hogy azonosítsa az új, illetve nem várt változásokat a fehérjékben, meghatározza a kölcsönhatásokat és módosulásokat, valamint teljes képet mutasson a sejtben lejátszódó folyamatokról.

„A proteomika napjaink egyik legizgalmasabb és legdinamikusabban fejlődő kutatási területe. Olyan új módszerről van szó, amely egyre kisebb és kisebb mennyiségű fehérjéről ad egyre több információt” – tájékoztatta magazinunkat Csősz Éva, a Debreceni Egyetem Általános Orvostudományi Karának adjunktusa. A Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet keretein belül működő Biomarker Kutatócsoport vezetője szerint a proteomikai eljárások segítségével megtudhatjuk, hogy milyen fehérjék – és azok milyen módosulatai – vannak az adott mintában, illetve milyen mennyiségben találhatók ott.
Világszerte gomba módra szaporodnak a jól felszerelt proteo­mikai központok, amelyek a legkülönbözőbb módszerekkel frakcionált, tisztított fehérjék analízisével remélnek választ adni számos fontos kérdésre. Ennek a kutatásnak az egyik legfontosabb eszköze a tömegspektrometria, amely éppúgy alkalmas nagy ér­zé­keny­ségű fehérjeazonosításra, mint kovalens jelölések helyének és kémiai szerkezetének meghatározására, sőt bizonyos esetekben akár a fehérjék térszerkezetének meghatározásában is nagy segítséget jelenthet. A hazai kutatóhelyek közül a Szegedi Biológiai Kutatóközpont Proteomikai Laboratóriuma számos hazai kutatócsoport számára biztosít szakmai hátteret, és vannak külföldi kollaborációik is. (A biológiai minta-előkészítést együttműködő partnereik végzik, a szegediek feladata az analitikai minta-előkészítés, a tömegspektrometriai mérések és az adatok kiértékelése.) A Tisza-parti intézmény különleges kutatási iránya az úgynevezett egysejt proteomika, azaz, hogy egyetlen sejtből milyen fehérjék mutathatók ki.

A proteomikai kutatások egyik legfontosabb eszköze a tömegspektrometria, amely éppúgy alkalmas nagy érzékenységű fehérjeazonosításra, mint kovalens jelölések helyének és kémiai szerkezetének meghatározására, bizonyos esetekben akár a fehérjék térszerkezetének meghatározásában is sokat segíthet.

A Szegedi Tudományegyetemen a neuroproteomikára koncentrálnak, míg a Pécsi Tudományegyetem munkatársai metszeteket készítenek, amelyeket nem mikroszkópba helyeznek, hanem tömegspektrométer segítségével határozzák meg az adott vegyület pontos elhelyezkedését a mintán belül. Az ELTE Természet­tudományi Karán peptidkémiai kutatásokat folytatnak, a Proteomikai Laboratóriumban végzett kutatások célja pedig az, hogy az emberi fehérjekészlet vizsgálatával olyan elterjedt betegségek mechanizmusaira kapjanak választ, mint a demenciák, az Alzheimer-kór vagy a depresszió. Az MTA TTK Proteomika Kutatócsoportjának egyik jelentős iránya a daganatokban előforduló fehérjék eltérő cukormódosulatainak a vizsgálata.
A Debreceni Egyetemen a különböző vírusfertőzésekre, így például a HIV-vírus sejtbe jutására adott választ tanulmányozzák. Ugyancsak fontos irány a biomarker-kutatás, amely ez esetben azt jelenti, hogy egyes betegségekre – cukorbetegekről és Alzheimer-kórban szenvedőkről van szó elsősorban – utaló fehérjéket keresnek a könnyben, a verejtékben és a nyálban. Mivel a verejték és a könny kis mennyiségben áll rendelkezésre, érzékeny technikákat alkalmaznak. Az elmúlt években hat olyan fehérjét sikerült azonosítani, amelyek mennyisége eltért a korai, illetve súlyos állapotú cukorbetegek könnyében. Alzheimeres betegeknél pe­dig olyan könnyfehérjét találtak, amelynek mennyisége eltért az egészségesekétől. Azt is elemzik, hogy valamilyen fehérje je­len­létére, illetve hiányára vagy megváltozott mennyiségére vissza­vezethető-e a zöldhályog-műtéten átesett betegek eltérő gyó­gyulása. A nyálproteomikai kutatások segítségével pedig a száj­üregi laphámrákra jellemző fehérjéket sikerült azonosítani, amelyek segítségével a jövőben akár szűrőprogramokat is el lehet majd indítani a magasabb kockázatú csoportok kiszűrésére és a betegség mielőbbi felismerésére.

Az emberi fehérjekészlet vizsgálatával olyan elterjedt betegségek mechanizmusaira kaphatunk választ, mint a demenciák, az Alzheimer-kór vagy a depresszió. A biomarker-kutatás például a cukorbetegségre utaló fehérjéket keres a könnyben, a verejtékben és a nyálban. A nyálproteomikai kutatások révén pedig a szájüregi laphámrákra jellemző fehérjéket lehet azonosítani, amelyek segítségével a jövőben akár szűrőprogramokat is el lehet majd indítani a magasabb kockázatú csoportok kiszűrésére és a betegség mielőbbi felismerésére.

Az előbbi példákból látszik, hogy valamennyi vezető kutatóhelyen foglalkoznak proteomikával. A kutatók szorosabb szakmai együttműködését segíti, hogy az egri konferencián megalakul a Magyar Biokémiai Egyesület Proteomikai Szakosztálya.
A proteomikai vizsgálatok gyakorlati célú felhasználása egyre terjed. Elsősorban a humán gyógyászatban használják, de az állattenyésztésben és növénytermesztésben is növekvő igény mutatkozik az ilyen jellegű vizsgálatokra. Az élelmiszeriparban is több területen alkalmazzák vizsgálati módszereit, melynek segítségével az élelmiszer-minőség és -biztonság is monitorozható. Csősz Évától tudjuk, hogy mind több olyan proteomikai tanulmány jelenik meg, melyek azt vizsgálják, hogy milyen hatással van az élelmiszer a fogyasztók egészségére és életfolyamataira, illetve hogy a feldolgozási folyamatok során hogyan változik az élelmiszerek fehérje-összetétele és ezzel összefüggésben annak bizonyos fizikai, kémiai és egyéb tulajdonságai.
„A tejjel és a tejtermékekkel kapcsolatos hamisítások komoly problémát jelentenek az élelmiszeriparban” – említ egy érdekes felhasználási területet Csősz Éva debreceni kutató. Ennek hátterében az áll, hogy a magas minőséget és pénzben kifejezett értéket képviselő termékekhez olcsó alapanyagokat kevernek. Ilyen hamisítás lehet, amikor bivalytejhez, kecsketejhez, illetve juhtejhez tehéntejet kevernek, és az ebből készült sajtot úgy értékesítik, hogy a tehéntej jelenlétét nem tüntetik fel. Ezeket a keverékeket nehéz beazonosítani. Manapság jellemzően a DNS-alapú eredetvizsgálat, a fajazonosítás az elterjedt, ennek ellenére a proteomikai módszerek (elsősorban tömegspektrometria-alapúak) is alkalmasak a tejből és tejtermékekből a felhasznált fajok azonosítására. Bizonyos fehérjék markerként szolgálnak, ezek a markerek jellemzőek egy adott fajra, jelenlétük tehát bizonyíthatja, hogy a fajból származó fehérje benne van a vizsgált termékben.

A proteomikai vizsgálatok az állattenyésztésben és növénytermesztésben, valamint az élelmiszeriparban is több területen alkalmazhatók. Segítségével az élelmiszer-minőség és -bizton­ság is monitorozható. A tejjel és tejtermékekkel kapcsolatos hamisítások komoly problémát jelentenek az élelmiszeriparban. A proteomikai módszerek alkalmasak például egy sajt esetében az ahhoz felhasznált tej forrásának fajok szerinti azonosítására.

A borok fehérjetartalma literenként 15–230 milligramm között változik. A bor fehérjéi származhatnak magából a szőlőből, illetve mikroorganizmusokból (élesztő), melyek az alkoholos erjedésben játszanak szerepet. A borfehérjék jelentősége többrétű, a bor minőségét befolyásolják, az íz és testesség kialakításában is fontos a szerepük. A pezsgőborok esetén a habzásért is a fehérjék felelősek. A borfehérjék azonban negatívan is befolyásolhatják a bor tulajdonságait, például gyakran zavarosságot okoznak, illetve a borok által kiváltott allergiás reakciókért is a fehérjék tehetők felelőssé. A borászok gyakran használnak fehérjealapú derítőanyagokat, mint például a glutén, tej kazein vagy a tojás ovalbumin, mert ezek segítségével eltávolíthatók az üledékek. Ezek a fehérjék gyakran okoznak problémát a borok eladásakor, ugyanis gyakori allergé­nek. A nem bor eredetű fehérjék kimutatására egyre inkább a tömegspektrometria-alapú módszerek kezdenek elterjedni, mivel ezek sokkal érzékenyebbek.

Negyedszer közösen
A Magyar Biokémiai Egyesület és a Magyar Genetikusok Egyesülete március 29. és 31. között Egerben rendezi meg negyedik közös szervezésű konferenciáját Molekuláris Élet­tudományi Konferencia 2019 (Hungarian Molecular Life Sciences 2019) címmel. A nagy múltú, rokon szakterületek kutatóit összefogó egyesületek 2013-ban hozták létre a leg­nagyobb hazai élettudományi konferenciát, melyet elhatározásuk szerint kétévente, így 2019-ben is megszerveztek. Hazai és külföldi tudományos műhelyekből mintegy négyszáz kutató részvételére számíta­nak. Az egyesített konferencia mindkét egyesület hagyományait folytatni kívánja. Az előző három konferencia sikerei alapján úgy látják, hogy a közös szervezés a hazai élettudományi konferenciák történetében egy lassan tradícióvá váló új minőséget hozott létre. Az idei konferencia célja, hogy fórumot teremtsenek a biokémia, a szerkezetbiológia, a sejtbiológia, a fejlődésbiológia, a klasszikus és molekuláris genetika, az emberi betegségek molekuláris biológiája, a rendszerbiológia, a szintetikus biológia, a genomika, vala­mint a bioinformatika területén dolgozó kutatók számára.


Az egri konferencia másik hangsúlyos témája a génszerkesztési eljárásokkal született eredmények bemuta­tása lesz. Erről a dinamikusan fejlődő területről tavaly novemberben a nagyközönség is sokat hallott – nem éppen pozitív kontextusban. A világsajtó vezető hírként tette közzé, hogy Kínában HIV-fertőzésre rezisztens csecsemőket hoztak létre genomszerkesztéssel. Csienkuj He kínai kutató és csapata HIV-fertőzött apától és egészséges anyától világra jött, elvileg egészséges ikrek génállományát az úgynevezett CRISPR-Cas9 technológiával tette HIV-rezisztenssé. A laikus közvéleményen és a politikusokon kívül a világ tudós társadalma is elítélte a beavatkozást.
„A CRISPR/Cas nukleázok megismerése és átprogramozása forradalmasította a genomszerkesztési eljárásokat és azokat a rokon területeket, ahol genomszerkesztett sejteket és élőlényeket hasznosítanak. A nukleázok olyan enzimek, amelyek nukleinsavakat, DNS-eket vagy RNS-eket képesek elhasítani. Vannak köztük olyanok, amelyek nem vagdossák csak úgy összevissza a DNS-t, hanem meghatározott szekvenciák mentén szabnak. Kémcsőben az ilyen nukleázokat használhatjuk DNS-ek szétvágására és az úgynevezett ligáz enzimek segítségével terveink szerinti újbóli összeillesztésére. Egy sejten belül persze mindez sokkal bonyolultabb, mint kémcsőben” – tájékoztatta magazinunkat Welker Ervin, a Szegedi Biológiai Kutatóközpont Biokémiai Intézetének tudományos tanácsadója.
Amikor kémcső helyett sejtekben dolgoznak, a szétvágás-összeillesztés során két fő problémát kell megoldani. Az egyik, hogy a sejtek DNS-én nehéz olyan szekvenciát találni, amely csak az adott helyen fordul elő, egyébként olyan helyen is elvágjuk azt, ahol nem terveztük. A másik, hogy a sejtben rengeteg fehérje van jelen, így nem tudjuk megoldani, hogy akkor és ott kapcsoljuk össze a megvágott DNS-t, ahol és amikor szükségünk van rá. Azonban a sokféle enzim jelenlétét és jól szabályozott működését ki is tudjuk használni a céljainkra. A DNS eltörése „életveszélyes” a sejt számára, a szabad DNS-végek megjelenése vészjelzésként funkcionál, és mentőakciókat indít be a sejtben a DNS kijavítására. Különböző javító mechanizmusok vannak, amelyek általában, de nem mindig, az eredeti DNS-szekvencia visszaállításával kijavítják az eltört DNS-t. Ám sok sejtben, ugyanott elhasítva a DNS-t, megnő annak a valószínűsége, hogy az adott gén szekvenciáját nem visszaállítják, hanem hibásan javítják ki. Ezeket a DNS-javító rendszer által elkövetett hibákat próbálják kihasználni a kutatók a kiválasztott gén terveik szerint való megváltoztatására.

A DNS eltörése „életveszélyes” a sejt számára, a szabad DNS-végek megjelenése vészjelzésként funkcionál, és mentőakciókat indít be a sejtben a DNS kijavítására. A DNS-törés kijavításakor a törés környékén megtalálható DNS-darabok illesztődhetnek be a törés helyénél. Az ilyen DNS-daraboknak a tudatos sejtbe juttatásával tervszerűen lehet megváltoztatni a genomot.

„Elsősorban kétféle hibát próbálunk előidézni és kihasználni. A ja­vítás során néhány bázispár betoldódhat vagy kieshet, ami a gén inaktiválódásával járhat. Emellett kromoszómán kívüli, a törés környékén megtalálható DNS-darabok illesztődhetnek be a törés helyénél a DNS-törés kijavításakor. Ilyen DNS-daraboknak a sejtbe való tudatos juttatásával terveinknek megfelelően változtathatjuk meg a genomot” – vázolja a lehetséges jövőt a szegedi kutató, aki szerint a CRISPR/Cas nukleázok megismerése azért idézett elő forradalmi fejlődést, mert a nukleáz egy vezérlő RNS-molekula segítségével választja ki a szekvenciát, amely mentén elhasítja a DNS-t. A vezérlő RNS-molekulát nagyon könnyű kicserélni a nukleázban, és így csupán néhány napos munka átprogramozni a nukleázt egy új célpontra.
Korábban olyan nukleázok voltak csak elérhetőek, amelyekben fehérje domén ismerte fel a DNS-szekvenciát. Egy ilyen nukleáz átprogramozása egy újabb szekvenciára hónapokig, akár egy évig is tarthatott. Továbbá a vezérlő RNS programozható szekvenciája húsz nukleotid hosszúságú, ami megfelelően hosszú ahhoz, hogy még az olyan komplex, nagy genomokban is, mint amilyen az emberé, sok szekvencia esetében csak egyszer forduljon elő. Az is javította a helyzetet, hogy sikerült egy olyan Cas9 nukleázt találni, amely nagyon aktív, és amelynek segítségével nagy hatékonysággal lehet a sejtek genomjában irányított változtatásokat létrehozni. Welker Ervin szerint ez szintén központi kérdés, mert a sejtek sokaságában csak néhányban történik meg a kívánt változtatás, amit utána a változatlan, vagy nem kívánt változást hordozó sejtek sokaságából ki kell válogatni. Hatékony módosítás esetén több sejtben lesz jelen a kívánt módosítás, így könnyebb őket megtalálni, kiválasztani a többi sejt közül.
Ezeknek a megváltoztatott genommal rendelkező sejteknek és élőlényeknek az élet nagyon sok területén van kulcsfontosságú szerepük. Természetesen fontosak a kutatásban: egy gén irányított megváltoztatása sokat segíthet a funkciójának a megértésében. Továbbá létrehozhatók olyan sejtek és modellélőlények, amelyekben a genetikai elváltozás egy adott betegséggel függ össze. Így nemcsak pontosabb képet lehet kapni a betegség patomechanizmusáról, hanem gyógyszerjelölt vegyületeket is lehet tesztelni ezeken a modelleken, amelyek megállíthatják vagy megfordíthatják a patológiás folyamatokat. Bármennyire is jók ezek az állatmodellek, előfordul, hogy a gyógyszer által megcélzott molekula, fehérje vagy enzim kismértékben eltér az emberi megfelelőjétől, emiatt az így talált vegyület embereken már ke­vésbé hatásos. Ezért szoktak olyan, úgynevezett humanizált állat- és betegségmodelleket létrehozni, ahol a modellállat genomját úgy változtatják meg, hogy saját enzimje, fehérjéje helyett annak emberi változatát tartalmazza. Így hatékonyabb gyógyszerek fejleszthetők. A módszerek ígéretesnek látszanak egygénes, genetikai eredetű betegségek gyógyítására is.
Az embrionális és a pluripotens őssejtek még sokféle sejttípussá képesek differenciálódni. Sikerült olyan módszert kifejleszteni, amellyel differenciált sejteket visszaprogramozhatnak pluripotens sejtekké. Ezzel lehetőség nyílik arra, hogy egy beteg hám- vagy vérsejtjeit kémcsőben nevelve a betegséget okozó gént kijavítsák és a sejteket visszaprogramozzák pluripotens sejtekké, majd a betegség szempontjából releváns sejttípussá differenciálják, és a beteg szövetek sérült funkcióját velük helyreállítsák.

Az embrionális és a pluripotens őssejtek sokféle sejttípussá képesek differenciálódni. Sikerült olyan módszert kifejleszteni, amellyel differenciált sejteket visszaprogramozhatnak pluripotens sejtekké. Ezzel lehetőség nyílik arra, hogy egy beteg hám- vagy vérsejtjeit kémcsőben nevelve a betegséget okozó gént kijavítsák, és a sejteket visszaprogramozzák pluripotens sejtekké, majd a betegség szempontjából releváns sejttípussá differenciálják, és a beteg szövetek sérült funkcióját velük helyreállítsák.

Amíg ezek az eljárások a klinikumban rutinszerűen alkalmazhatóak lesznek, még sok problémát kell megoldani. Fontos kérdés, hogy a szándékolt genetikai változások minél több sejtben jöjjenek létre pontosan, más nem szándékolt változtatás nélkül. Ez utóbbi különösen fontos, hiszen a nukleázok nemcsak a vezérlő RNS-üknek megfelelő szekvenciáknál hasítják el a DNS-t, hanem arra csak emlékeztető szekvenciáknál is. Ez az úgynevezett off-target hatás eddig gyakorlatilag kizárta a módszer biztonságos használatát, például a klinikumban.
Ezeknek a céloknak az elérésére a kutatók több megközelítéssel is próbálkoznak. Az egyik talán legérdekesebb megoldás­ban olyan fehérjemutációkat találtak, amelyek ezt az off-target hatást radikálisan mérsékelték. Sajnos ez együtt járt az ilyen nukleáz­variánsok által elérhető szekvenciák jelentős csökkenésével. A nukleáz szerkezetének ismeretében magyar kutatók olyan variánsokat fejlesztettek ki, amelyek megtartották a variánsok nagyobb pontosságát, off-target mentességét, de lehetővé tették gyakorlatilag mindazon szekvenciák szerkesztését, amelyek elérhetőek a vad típusú nukleáz számára, bár nagyobb mértékű off-target hatás mellett. Másik ígéretes megközelítés az úgynevezett bázisszerkesztők (base editor) kifejlesztése, ahol a nukleáz olyan változatát használják, amely a DNS-kötés helyén megváltoztatja a kiválasztott nukleotid fajtáját, pontmutációt hozva létre. Minthogy ez nem feltétlenül jár együtt kettős szálú DNS-töréssel, a kutatók azt várják, hogy kisebb lesz az off-target hatás.•

 
2019. október – Közlekedésfejlesztési különszám

2019. október – Közlekedésfejlesztési különszám

Hírlevél feliratkozás

Innotéka